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高科技檢測儀器之熒光檢測器

2010-12-24

                                                 高科技檢測儀器之熒光檢測器
     熒光是一種特殊類型的發(fā)光現(xiàn)象，是分子被電磁波輻射后產(chǎn)生的光，也稱光到發(fā)光。
     吸收能量的分子中的電子被激發(fā)從低能階到高能階，在躍遷的過程中電子吸收能量使紫外光的強度降低。這就是紫外吸收檢測器的原理。如果電子吸收了多余的能量沖出了紫外吸收的范圍到達(dá)更高的能階，在回到低能階的路途中因與其它分子的碰撞或其它原因，這些高能電子不會很快消失，當(dāng)它們到達(dá)一個特定次高能階時一下子降到一個特定的次低能階，這個過程產(chǎn)生的光就是熒光，亦發(fā)射熒光。
    電子碰撞后失去了一些能量，故發(fā)射熒光（em）的總比激發(fā)熒光（ex）的波長長。激發(fā)熒光的能階常與紫外吸收的能階相同或相近。
    熒光檢測器不像紫外吸收檢測器那樣設(shè)計成直通光，這樣避開了激發(fā)光和發(fā)射熒光之間的干擾，多數(shù)采用90°角的光路，所用燈與紫外吸收檢測器的燈相同，一般用氙燈，也是光電倍增管作為敏感器。
    有一種增強型凹鏡式熒光檢測器，反射性的樣品池安裝在凹面鏡的中央，光源通過凹面鏡的狹縫照到樣品池上，樣品池的一面不透光而將光線反射到凹面鏡上，經(jīng)聚焦照射到光電倍增管上，避免了激發(fā)光通過樣品直射擊到光電倍增管，不但增強了輸出信號，而且防止了干擾。
    熒光檢測器有極高的靈敏度和良好的選擇性，其靈敏度比紫外吸收檢測器高出10～1000倍，而且需要的樣品量少。許多化合物芳香族化合物，特別是多環(huán)芳烴和稠環(huán)芳烴用熒光檢測有極高的靈敏度，在環(huán)境監(jiān)測方面用處極大。許多生化物質(zhì)，如有機按類、維生素、激素、酶等到對熒光檢測器也有很高的靈敏度。在生命科學(xué)研究中，熒光檢測器也是不可缺少的工具。
    以上所提到的這些種類的化合物的分子中的電子被激發(fā)后能吸收多余能量到達(dá)更高能階，所以用熒光檢測器檢測。
    苯丙氨酸是人體內(nèi)必需的氨基酸，主要由膳食途徑供給，人體內(nèi)不能合成。苯丙氨酸除了被用于合成蛋白質(zhì)外，主要是代謝生成酪按酸，僅有少部分經(jīng)轉(zhuǎn)按酶作用生成苯兩酮酸：
    若人體先天性缺少苯丙氨酸羥化酶，不能殷苯丙按酸氧化成酪氨酸，血中積聚了過量的苯丙按酸，經(jīng)轉(zhuǎn)氨酶作用氧化成代謝物苯丙酮酸。這些異常代謝物—苯丙酮酸從尿中排出，稱為上腺素含量降低，皮膚及毛發(fā)顏色淺、智力停留在兒童水平，壽命縮短。究其原因，一方面高濃度的苯丙酮酸聚集于中樞神經(jīng)，抑制了谷氨酸脫羧作用，影響了神經(jīng)介質(zhì)-氨基丁酸的合成；另一方面苯丙酮酸可能抑制了另一種神經(jīng)介質(zhì)-羥色胺的合成。
    臨床上需要測定血中苯丙氨酸水平，以確診苯丙酮尿癥及觀察正在接受治療的苯丙酮尿癥病從血清中苯丙氨酸水平的變化。對于新生兒苯丙氨酸的篩查尤為重要，是預(yù)防和治療先天性代謝疾病——造成兒童智力低下的苯丙酮尿癥的有效辦法。盡管苯丙酮尿癥的發(fā)生率僅為萬分之一，但我國人口若懸河基數(shù)大，進行此項工作有重要意義。患苯丙酮尿癥的新生兒經(jīng)早期治療，早期禁食含苯丙氨酸的膳食，早期進行特殊的教育，可收到良好的效果。
    測定血中苯丙氨酸含量的更好方法是HPLC-熒光檢測器測定法，對于新生兒僅需臍帶血200～300uL。利用L-亮氨酰-L-丙氨酸二肽存在使水合茚三酮和銅離子與苯丙氨酸縮合成很穩(wěn)定的熒光物質(zhì)。采用反相色譜梯度洗脫方法，ex為365～390nm,em為489～515nm。測定結(jié)果表明：
    正常人血清苯丙氨酸含量，成人為（95±20）unol/L;嬰兒為（74±25）unol/L。如果血清中苯丙氨酸的含量大于250unol/L，可視為患有苯丙氨酸代謝的遺傳性缺陷癥。